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动脉粥样硬化atherosclerosis AS是全身性疾病高血脂高血压吸烟致继发性高脂血症的疾病遗传因素和其他因素都能导致AS的发生目前寻找经济安全有效的抗动脉粥样硬化药物成为当今医学的一大热点和难题

[1]动脉粥样硬化是一种慢性炎症和免疫性疾病免疫和非免疫因素导致内皮功能紊乱 从而启动动脉粥样硬化的发展 补体是免疫系统中的重要效应子大量证据表明补体系统参与了动脉粥样硬化发生发展的整个过程

[2]经研究证实补体系统的激活产物如调节蛋白补体受体均可在动脉粥样硬化的病灶尤其是易损斑块和已破裂斑块中被探及并且经过对人体病变的研究发现膜攻击复合体的沉积量与病灶进展程度呈现正相关而补体调节蛋白CD59就是补体膜攻击复合物MAC组装的一个关键调节子具有抑制补体膜攻击复合物形成的作用

[3]脂质体是由脂质双层分子构成的环形封闭泡囊作为基因转移的非病毒载体具有无毒使用方便无免疫源性转染率较高的优点

[4] 包埋目的基因后通过尾静脉注射有一定的药物动力学作用

[5] 钝顶螺旋藻Spirulinaplatensis中的藻蓝蛋白C-phycocyaninCPC具有很高的医疗价值如有改善血脂代谢抗氧化抗肿瘤抗衰老提高机体免疫力等功效[6] 因其安全无毒水溶性高含量高易提取等特性被广泛用于化妆品和食品的添加剂 动脉粥样硬化是由内皮功能紊乱引起的。而藻蓝蛋白能促进动物细胞再生进而修复损伤的内皮细胞并诱导坏死细胞凋亡进而调控机体的内皮功能 且其改善血脂代谢和清除自由基等异物的生理活性又能有效地抑制高脂血症的发生 由此推测 藻蓝蛋白对动脉粥样硬化的治疗具有一定的积极作用

本文将补体调节蛋白CD59与CPC的特性结合起来 通过对高脂饮食ApoE-/-小鼠转染入CD59基因CPC灌胃给药以及CD59基因和CPC的联合作用 研究CPC对动脉粥样硬化小鼠中CD59表达量的影响 并探讨CPC对ApoE-/-小鼠的抗动脉粥样硬化作用是否是通过促进CD59基因的表达来减缓或抑制动脉粥样硬化的发生发展 揭示藻蓝蛋白抗动脉粥样硬化作用的机制。

材料与方法
实验材料与仪器:ApoE-/-小鼠40只雌雄各半购自北京维通利华实验动物技术公司,钝顶螺旋藻片购自浙江宾美生物科技有限公司 ,2000转染试剂购自Invitrogen公司,胆固醇购自Sigma公司, 猪胆盐购自Solarbio公司抗小鼠CD59多克隆抗体购自美国Santa公司,EndoFree Plasmid ezFlow Maxiprep Kit 无内毒素质粒大提试剂盒购自BIOMIGA公司, RNAiso PLUS试剂盒与PrimeScript RT-PCR Kit购自TaKaRa公司,核酸蛋白测定仪购自Eppendorf公司,台式恒温振荡器购自太仓市华美生化仪器厂,低温高速离心机KR-1500购自KUBOUA公司,电子天平与颗粒制冰机购自日本Sanyo公司。藻蓝蛋白的提取250 g钝顶螺旋藻片充分研磨至粉状加入浓度为0.1 mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液PBS500 ml于4 浸泡30 min搅拌均匀-20和38 反复冻融10次 静置30 min4 000 r/min离心40 min 将上清液与等体积的饱和硫酸铵溶液混匀在4 下盐析24 h 盐析所得沉淀4 000 r/min离心40 min得藻蓝蛋白用50 ml PBS溶解置于截留相对分子质量为8 000~14 000的透析袋中1 000 mlPBS透析去除铵离子得CPC混悬液[6] 核酸蛋白测定仪测定CPC溶液的浓度
造模与给药方法
造模方法与给药剂量将40只ApoE-/-小鼠随机分为4组每组10只雌雄各半高脂饲料喂养配方普通饲料80% 猪大油15% 胆固醇2% 全脂奶粉1.5% 蛋黄粉1.3% 猪胆盐0.2%[7] 给药剂量CPC质量浓度为31.32 mg/ml以100 mg/kg进行灌胃给药 每只小鼠 约30 g 每次给药0.1 mlCD59-pIRES质粒质量浓度为117 g/ml 与脂质体包埋后形成CD59-pIRES-脂质体复合物 此时质量浓度为97.5 g/ml 每只小鼠每次注射约0.5 ml1.3.2 分组方法第1组对照组只喂食高脂饲料作为对照第2组CPC处理组采用CPC混悬液灌胃法给药每周2次 第3组CD59处理组将CD59-pIRES-脂质体复合物通过尾静脉注射给药 以实现将CD59基因转染入小鼠细胞内的目的[8] 每周2次第4组CD59+CPC处理组在进行CPC灌胃给药的同时通过小鼠尾静脉注射CD59-pIRES-脂质体复合物每周2次 将4组小鼠高脂饲料喂养并药物处理12周各组小鼠和蛋白表达量的检测。
 RT-PCR检测血中CD59 mRNA水平小鼠空腹12 h麻醉后摘眼球取血 用RNAiso PLUS试剂盒提取4组小鼠全血的Total RNA 用PrimeScriptRT-PCR Kit试剂盒进行逆转录反应合成cDNA 再取逆转录产物进行PCR扩增 根据引物设计软件设计CD59上游引物5-TGGACAATCACAATGGGAATC -3 CD59下 游 引 物5-TGCTGCCAGAAATGGAGTCAC-3 在PCR仪上按下列条件进行PCR反应94 预变性2 min94 变性30 s47 退火1 min68 延伸2 min第2~4步40个循环后68 终延伸7 min 扩增产物长度为378 bp 内参GAPDH扩增产物长度为509 bp1.4.2 Western blot检测组织细胞中CD59蛋白的表达解剖4组小鼠切除肝脾心脏及主动脉等组织放入预冷的生理盐水漂洗数次洗去血迹每组称0.45g组织放入研钵按组织净质量裂解液体积为12的比例加入裂解液进行研磨直至将组织研磨成浆状 离心收集蛋白 测定蛋白质量浓度 SDSPAGE电泳分离蛋白将目的蛋白转印到PVDF膜上封闭2 h分别加入兔抗鼠CD59 r 20 000 和兔抗人内参-actin r 43 000 的一抗在4 孵育过夜辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h 化学发光显色通过Image J图像分析软件分析条带情况[9]血脂生化水平的检测其余血液静置送检检测血清中的各项生化指标总胆固醇TC 甘油三酯TG 载脂蛋白B(ApoB)低密度脂蛋白LDL 高密度脂蛋白HDL[10]染色观察动脉粥样硬化斑块开胸 分离主动脉根部避免挤压取主动脉标本4%多聚甲醛固定做连续石蜡切片HE染色[11] 光学显微镜下观察动脉粥样硬化斑块形成情况统计学分析利用SPSS17.0统计软件分析处理数据数据结果以的均数标准差表示组间比较采用检验 0.05为统计学有显著性差异结果各组 小鼠 表达水平RTPCR结果通过凝胶图像分析系统分析 各组小鼠之间CD59 mRNA表达量有明显差异图1a 通过灰度值分析 与对照组相比CPC处理组CD59 mRNA表达水平有所升高 说明藻蓝蛋白可以促进血细胞CD59 mRNA的表达 CD59转染组CD59 mRNA水平与对照组相比也有明显升高这表明CD59基因已成功转染入血细胞中图1b各组 小鼠 蛋白的表达量通过Western blot方法检测各组小鼠组织中CD59蛋白的表达情况结果如图2a所示各组均检测到CD59的不同表达程度的蛋白条带 各组蛋白条带的灰度值经校正后分析显示图2b 与对照组相比CD59处理组CPC处理组与CPC+CD59处理组的CD59蛋白表达量均有显著升高 且CPC+CD59处理组与对照组CD59表达量的差异更为显著 结果表明CPC能促进小鼠体内组织中的CD59蛋白的表达 CD59高表达质粒的转染也在一定程度上增加了CD59蛋白表达量这表明CD59基因已成功转染入小鼠组织细胞中 以上结果与mRNA水平检测结果相一致各组 小鼠血清血脂生化水平的变化比较同龄的高脂饮食对照组小鼠与正常饮食小鼠的各项血清血脂生化指标表1 可以发现高脂饮食对照组 小鼠的TGTCApoBLDL水平 均显著 升 高而HDL水平降低且差异显著 0.05 证明ApoE-/-小鼠经高脂饲料喂养后形成高脂血症能够诱导动脉粥样硬化的发生 对各实验组ApoE-/-小鼠的血清血脂水平进行比较发现与对照组相比各组ApoB浓度没有明显差异CPC处理组CD59处理组的TGTCLDL浓度均有显著的降低趋势 0.05 但HDL浓度与对照组相比明显升高 而CD59+CPC处理组与对照组相比对血脂的调控作用更为明显 0.01表2 结果表明CPC处理组与CD59处理组的血脂水平均有显著地降低 并且CD59+CPC处理组比两者单独给药效果更显著能更进一步的降低小鼠体内的血脂水平减缓高脂血症的形成进而抑制动脉粥样斑块的形成各组 小鼠动脉粥样硬化斑块的观察主动脉标本经HE染色后镜下观察可以观察到各组有明显的形态学差异[12] 高脂饮食对照组可见内膜明显增厚完整性遭到破坏斑块形成中层平滑肌细胞经弹力板迁入内膜并发生增生转化斑块形成图3a 与对照组相比CPC处理组与CD59处理组均可发现部分内膜明显增厚完整性开始遭到破坏但都未见明显的动脉粥样硬化斑块形成 图3bc 而CD59+CPC处理组管腔内侧有一层连续平滑的内皮细胞内膜无明显增厚未形成明显的斑块图3d结果说明CPC与CD59均能在一定程度上减缓动脉粥样硬化斑块的形成 并且CD59与CPC联合作用比两者单独给药效果更显著能进一步的减缓甚至抑制动脉粥样硬化斑块的形成

讨论

动脉粥样硬化atherosclerosis AS是全身性疾病高血脂高血压吸烟致继发性高脂血症的疾病遗传因素和其他因素都能导致AS的发生大量流行病学调查证明高脂血症是动脉粥样硬化发生的危险因素高脂血症是指血浆总胆固醇和甘油三酯异常增高[1]AS的严重程度随血浆胆固醇水平的升高而加重目前认为氧化LDLox-LDL 是最重要的致粥样硬化因子 是损伤内皮细胞和平滑肌细胞的主要因子 HDL可通过胆固醇逆向转运机制清除动脉壁的胆固醇还有抗氧化作用可防止LDL的氧化并可抑制LDL与内皮细胞的受体结合而减少其摄取[13] 因此LDL浓度是判断AS的最佳指标而HDL水平会随着AS病变的加重而降低本实验中ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养12周后其TGTCLDL浓度比普通喂养的ApoE-/-小鼠显著升高而HDL降低提示高脂血症的形成表1 主动脉根部切片在光镜下观察发现内膜增厚完整性遭到破坏有明显的动脉粥样硬化斑块形成 上述结果表明动脉粥样硬化小鼠模型构建成功补体系统参与了动脉粥样硬化发生 发展的整个过程 膜攻击复合体的沉积量与病灶进展程度呈现正相关细胞分化抗原59(Cluster of differentiation59, CD59)是一种糖基磷脂酰肌醇GPI锚固型糖蛋白是补体膜攻击复合物MAC组装的一个关键调节子具有抑制补体膜攻击复合物形成的作用CD59可与C8C9结合 阻碍MAC C5b-9复合物的生成具有调控补体活性从而保护宿主细胞免受补体溶破的作用[14] 国外研究发现CD59与创伤炎症和某些肿瘤的发生有关[15] 本实验通过RT-PCR与Westernblot反应 证实了CPC能够促进小 鼠体内CD59mRNA与CD59蛋白的表达量 另外静脉注射脂质体复合物是转染目的基因的有效形式可提高生物利用度[16] 本实验通过比较对照组与CD59处理组中CD59的表达水平图1,图2 证实CD59基因通过脂质体包埋小鼠尾静脉注射已被成功转染入小鼠血

液和组织细胞中我们进一步针对藻蓝蛋白和CD59基因对ApoE小鼠动脉粥样硬化的发生 发展的影响进行了探讨

通过血清血脂生化指标检测和主动脉标本HE染色发现 与对照组相比CPC干预与CD59转染均能在一定程度上降低血脂水平表2 抑制内膜增生和动脉粥样硬化斑块形成图3bc d 减缓动脉粥样硬化的发生而且CPC和CD59联合作用效果更显著能进一步的减缓甚至抑制动脉粥样硬化斑块的形成

综上结果

我们发现藻蓝蛋白可以促进动脉粥样硬化小鼠体内CD59基因的表达而CD59又被证实具有降低血脂水平和延缓动脉粥样硬化发生发展的功能 那么我们推测藻蓝蛋白的抗动脉粥样硬化作用可能是通过调控ApoE-/-小鼠体内CD59基因的表达来实现的 本研究为动脉粥样硬化的药物和基因治疗提供了新思路和新方法

参考文献
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[8] 田代志高脂饲料喂养及颈部注射硬化剂制作痰浊眩晕