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藻蓝蛋白的抗癌活性研究*

王 勇1,钱 峰1,钱凯先1,董 强2
(1.浙江大学生物技术系,浙江杭州310027;2.山东省医学科学院,山东济南250062)
 摘 要

        活细胞脱氢酶催化四唑盐(MTT)还原,生成溶于有机溶剂的蓝色甲月赞结晶,可定量反映细胞生长.流式细胞技术可根据细胞中DNA的质量分数来检测其所处的细胞周期.采用上述两种方法,研究了藻蓝蛋白(PC)对HeLa细胞的抗癌活性.实验证明,PC对HeLa细胞生长有明显的抑制作用,当PC浓度为80 mg/L时对癌细胞的抑制率达31.0%.初步认为这种抑制机理为:PC使HeLa细胞由合成期(S)或分裂期(M)向G1期转变和积集,细胞DNA合成衰减.
    关键词:螺旋藻;藻蓝蛋白;四唑盐;流式细胞技术;人子宫颈癌细胞(HeLa细胞)
中图分类号:Q17     文献标识码:A     文章编号:1008-973X(2001)06-0672-04
    螺旋藻(spirulina)的蛋白质高达50%~70%,其中,藻蓝蛋白(PC)占总蛋白的7%左右.PC具有特征性的吸收光谱和荧光光谱是一种新颖的荧光分子探针[1,2].随着生物学、医学、海洋药物学等学科的发展,PC的生物活性已成为人们关注的热点.饭岛登等(1982)发现PC可提高淋巴细胞活性,增强机体抵抗力,继而在1983年发现PC能维持和促进正常受控细胞的功能,防止肿瘤的生长和复发.抗肿瘤药物的体外筛选,通常有染料排除法,软琼脂克隆法和[3H]胸腺嘧啶掺入法等[3].但这些方法准确度较差,重复性低、操作复杂,实验周期长.本文采用MTT法[4]和流式细胞技术对PC的抗癌活性进行了研究.
1 材料与方法
1.1 实验材料
HeLa细胞株(人子宫颈癌细胞),由浙江省肿瘤医院提供. PC由浙江大学生物科学与技术系细胞实验室纯化制备.
1.2 主要试剂
RPMI1640培养基(Gifco Co),胎牛血清(杭州四季青生物工程公司),胰蛋白酶trypsin (Difco进口分装),MTT (Sigma Co),二甲基亚砜DMSO(Merck Co),Triton x-100(Sigma进口分装),RNase A(Sigma),PI染料(Sigma)等.
1.3 溶液配制
PBS液:每升溶液含NaCl 8.00 g、kCl 0.020 g、Na2HPO4·H2O 1.56 g、KH2PO40.3 g, 15磅灭菌15 min.
Hanks液:每升溶液含NaCl 18.40 g、kCl 0.40 g、CaCl20.14 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、Na2HPO4·H2O 0.06 g、KH2PO40.06 g, NaHCO30.35 g,葡萄糖1.00 g,酚红0.02 g,8磅灭菌20 min.
D-Hanks液:每升溶液含NaCl 8.00 g、kCl 0.40 g、Na2HPO4·H2O 0.06 g、NaHCO30.35 g、酚红0.02 g,8磅灭菌20min.
Trypsin-EDTA液:Trypsin (Difco 1:250) 0.5 g、EDTA 0.2 g,1 000 mL D-Hanks液,用NaOH调pH至7.5,超滤除菌.
MTT液:用PBS深解成5 g/L,超滤除菌,4℃避免保存.
1.4 主要仪器
CO2自动细胞培养箱(VWR Model 1720, Forma Co. USA),酶标仪(EIA-11,上海四达生物技术研究所),流式细胞仪(Becton Dickinson Co. USA),细胞培养瓶(25 mL), 96孔板,24孔板(华美公司).
1.5 HeLa细胞的培养
无菌条件下,将HeLa细胞放于RPMI1640+20%胎牛血清的培养基中,置于37℃,5%的CO2中培养,细胞形成单层后进行传代培养.
1.6 MTT法检没PC对HeLa细胞生长的抑制作用
用Trysin-FDTA消化单层HeLa细胞,离心除去上清液,加培养液配成细胞悬液,并以1.0×105细胞孔接入96孔板.共设5组,每组8孔,每孔100LL.培养24 h后,更换新鲜培养液.其中4组为实验组,每组每孔分别加入100LL质量浓度为20、40、80、160 mg/L的PC液,使PC最终作用质量浓度分别为10、20、40、80 mg/L.另一组为空白对照组,每孔加100LL PBS.于37℃培养72h后,加入MTT液,20LL/孔,37℃温育4 h,弃培养液,加入DMSO或无水乙醇( 100LL/孔),轻微振荡使甲月赞结晶充分溶解,用酶标仪在490 nm测定OD值,按下列公式计算抑制率:抑制率=1-实验组OD-对照组OD-×100%.以细胞浓度1.0×104、1.5×104、2.0×104、2.5×104、3.0×104个/孔,分别接入96孔板,每组8孔培养24 h后,每孔加20LL MTT,用MTT法测各级490 nm OD值,并与细胞密度对应坐标图得出线性归迹.
1.7 流式细胞技术检测PC对HeLa细胞的抗癌活性方法
试验设4个组、每组3瓶,每瓶接入2 mL(2×105cells/mL)的细胞悬液,置于37℃,5%CO2培养24 h后,试验组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)分别加入1 g的PC液100、200、300LL,其中,Ⅰ、Ⅱ分别再补加200、100LL PBS.空白组每瓶加300LL PBS.轻微振荡后,继续培养72 h.用Trysin-EDTA消化各组,合并,3 000×10-6r/min离心10 min,弃上清液,用PBS离心洗涤细胞两次,70%乙醇固定.然后再用PBS离心洗涤两次,细胞沉淀加入1 mL 1% Triton x-100(25℃,10 min), 3 000×10-6r/min离心5 min弃上清,PBS洗涤两次,加入1 g/L RNaseA l mL (37℃, 10 min);然后室温下用PI染色处理.振荡成均匀悬液,上机检测.
2 实验结果与讨论
2.1 PC对HeLa细胞的细胞毒作用
实验结果表明,PC对HeLa细胞的抑制作用随PC浓度的提高而明显增强,抑制率由3.5%增至31.0%(表1)
表1 MTT检测的PC对HeLa细胞的抑制作用
Tab.1 The inhibition activity of phycocyanin to Hela cells (MTT test)
PC浓度/(mg·L-1)OD OD±S抑制率/%
空 白0.625 0.621 0.650 0.643 0.619 0.627 0.636 0.619 0.630±0.012—
10 6.14 0.588 0.578 0.620 0.617 0.619 0.594 0.625 0.603±0.017 3.5
20 0.565 0.580 0.573 0.575 0.568 0.570 0.587 0.528 0.575±0.010 3.7
40 0.543 0.531 0.555 0.529 0.546 0.530 0.547 0.539 0.540±0.011 14.3
80 0.415 0.423 0.447 0.432 0.419 0.449 0.469 0.426 0.435±0.020 31.0
2.2 PC对HeLa细胞周期的影响
利用流式细胞仪对试验各组HeLa细胞DNA进行分析,表2为各组中细胞周期所占的比率.从实验结果可知:PC可影响HeLa细胞由合成期(S)和分裂期(M)向G1期转移,并且这种转移随PC浓度的增强而增加(图1). G1期细胞的比率逐步增加,而(S+G2+M)期的细胞比率逐步减小,说明PC可使HeLa细胞停滞于G1期,阻止了细胞的DNA复制和分裂.
表2 样品中细胞周期各时期所占百分比
Tab.2 The percentage of different phyase in cell division cycle
PC浓度/(mg·L-1) G1/% S/% G2+M/% S+G2+M/%
空 白19.9 76.0 4.1 80.1
43.5 31.5 64.5 4.0 68.5
87.0 40.3 56.1 3.6 59.7
130.5 50.9 45.6 3.5 49.4
A:空白,B:PC最终浓度43.5Lg/mL,C:PC最终质量浓度87.0Lg/mL,D:PC最终质量浓度130.5Lg/mL
  以上实验结果表明,PC对体外培养的HeLa细胞有较好的抑制生长作用,且随PC剂量从10 mg/L增高至80 mg/L,抑制率逐步提高,可从3.5%升高至31.0%.流式细胞技术可进一步对活细胞的细胞周期进行检测,从细胞的DNA合成活性来检测PC的抗癌活性. PC使HeLa细胞由S、G2、M期向G1期转变和积聚,这是DNA合成静止期,说明DNA合成逐步衰减.
初步认为这可能是PC抑制癌细胞生长的机理.通过RNaseA处理除去细胞中的RNA,再用DNA染料PI对DNA进行荧光染色,流式细胞仪可根据每个细胞中DNA的质量分数分辩出每个细胞所处的细胞周期,并给出1万个细胞以上所处细胞周期的统一数据.各种细胞周期的峰值和数据非常精确,使本文研究结果十分可靠.PC是由藻蓝素与藻胆蛋白共价结合的大分子复合物.藻蓝素是一种分子质量约0.6 kD的开链四吡咯环化合物,其分子上的乙叉基与藻胆蛋白多肽链上的半胱氨酸以硫醚键共价连接.在分离和纯化PC时是按蛋白质纯化程序进行的,PC是一种蓝色的蛋白质药物分子.
参考文献:
[1] VERNON J O I, GLAZER A N. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules
[J]. J Cell Biol, 1982, 93:981-986.
[2] HARDY R R, HAYAKAWA K, PARKS D R,et al. Demonstration of B-cell maturation in X-linked
immunodeficient mice by simultaneous three-colour immunofluorescence[J]. Nature, 1983, 306:270-272.
[3] HONGO T, FUJII Y, IGARASHI Y. An in vitro chemosensitivity test for the screening of anti-cancer drugs
in childhood leukemia[J]. Cancer, 1990, 15:65(6):1263-72.
[4] MOSMANN T. Rapid colorilmetric assay for cellular growth and survial: Application to proliferafion and
cytoxicity assays[J]. J lmmunol Methods, 1983, 65: 55-59.