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    藻蓝蛋白(PC)具有特征性吸收光谱和荧光光谱 , 是一种新颖的荧光分子探针. 为了获取高纯度 PC , 经过反复探索研究建立了 Sep hadex G 2 200 、D EA E 2Se p hadexA 2 25 、HA 、Sep hadex G 2 200 的分离纯化程序 。此法效果 理想 : PA GE 显示为单条电泳带 ; 纯度值 ( A 615 / A 280) 高达 14 , 突破了国内外报告的最高值. 

关键词:藻蓝蛋白,螺旋藻 , 柱色谱层析 , 荧光光谱

学科分类号   Q2251    

        螺旋藻细胞蛋白质含量高达干重的 50 %~70 % , 其中藻蓝蛋白占总蛋白质的 7 %左右. 这是一类稀有的光合作用色素蛋白 , 仅存于蓝藻和红藻中 , 藻蓝素是一种分子质量约 016 ku 的开链四吡咯化合物 , 其分子上的乙叉基与多肽链上的胱氨酸 以硫醚键共价连接构成藻蓝蛋白. 因此 , 藻蓝蛋白的分离纯化是按蛋白质的柱色谱层析进行设计的.PC 通常为六聚体 ( α β )6 , 与之相近的别藻蓝蛋白为三聚体 ( α β )3 , 在分离纯化中必须去除别藻蓝蛋白 , 同时保持 PC 的荧光活性 , 这是提高 PC 纯度值的关键. 藻蓝蛋白可作为荧光分子探针[ 1 ], 并且有抗肿瘤活性 , 提高免疫机能等功能 , 受到国内外的重视.

 1   材料与方法  

1.1 实验材料:盐泽螺旋藻变种 ( S pi rul i na s ub sal sa v ar) 由浙江大学生物科学与技术系细胞研究室培养和保存. 

1.2 主要试剂:S ep hadex G 2 200 ( Phar macia C o . ) 、D EA E 2S ep hadexA2 25 ( Phar macia C o . ) 、HA ( 上海华美公司) 、 L2 巯基乙醇 ( Fl uka C o . ) 、聚乙二醇 、丙烯酰胺 、甲 叉 丙 酰 胺 ( Bi o2Red C o . ) 、Phyc ocyani n ( S i gma C o . ) . 标准蛋白 ( M = 1715 , 94 ku , 上海东风生化试剂厂) 等. 

1.3 主要仪器 : L R H 2 250 2G 自动光照培养箱 、超声波细胞破碎器 (B2 30 型 , Brans o n ul t r o s o nics C o . ) 、 紫外2 可见扫描式分光光度仪 ( DU2 50 型 Bechman C o . ) 、紫外2 可见分光光度计 ( 7520 型 、上海第二分析仪器厂) 、荧光分光光度仪 ( 850 型 、Hi t achi C o . ) 、高速冷冻离心机 ( 20 RP 2 52D 型 、Hi t achi C o . ) 、 标准层析柱 ( 华美公司) 、自动部分收集器 ( BSZ 2160 型 、 上海沪西仪器厂) 、恒流泵 ( HL2 2 型 、上海新波无线电厂) 等. 

1.4 螺旋藻的培养 :

        培 养 基 成 分 : NaNO3 、N H4 NO3 、 K 2 HPO4 、Na HCO3 、MgSO4 、NaCl 、CaCl2 、FeCl3 、微 量 元素等.

        培养条件 : 将藻体装入三角瓶置于自动光照培养箱中 , 3 000 L ux 、28 ~30 ℃ 条件下 , 培养 7 d , 每升培养液可获取 10~20 g 湿重藻细胞. 

1.5 藻蓝蛋白的粗提和盐析 

1.5.1粗提 : 20 g 螺旋藻 ( 湿重) 用蒸馏水洗涤两次后 , 悬浮于 0.001 mol/ L 磷酸缓冲液 ( P BS)中 , 置 4 ℃ 过夜 , 反复冻融 , 然后用超声波发生器冰浴中超声破碎细胞 9 mi n ( 每 3 分钟间歇 1 mi n) ,以 10 000 r/ mi n 4 ℃ 离心 1 h , 去细 胞 碎 片 获 上清液. 

1.5.2 盐析 : 在上清液中加 30 %~60 %饱和度硫酸铵 , 4 ℃ 静置盐析 24 h , 15 000 r/ mi n 4 ℃ 离心30 mi n , 收集蓝色蛋白沉淀 , 溶解于少量 P BS 中 ,置入透析膜 ( 截留分子质量 12 ku) , 在0.01 mol/ LP BS ( p H 7.0 ) 中 搅 拌 透 析. 截 留 液 以15 000 r/ mi n 离 心 10 mi n , 获 上 清 液 , 即 上 柱样品. 

1.6 柱色谱层析分离 

1.6.1 S ep hadex G 2 200 柱层析 : S ep hadex G 2 200充分溶胀抽气后装柱 , 柱型为 : 2.6 cm × 60 cm ,流速 15 ml/ h , 核酸蛋白仪灵敏度为 0.5 A , 记录仪走纸速度 3 cm/ h , 管速 3 管/ h , 根据洗脱峰和A 615 / A 280比值 , 收集较浓的 PC 管部分 

1.6.2 D EA E 2S ep hadexA2 25 柱层析 : 经上述分离得到的蛋白质液反透析浓缩后 , 再对 0.005 mol/ L PBS (p H 710) 透析 , 离心去沉淀. 柱型 1.6 cm ×20 cm 、 流速 15 ml/ h , 检测灵敏度 0.2 A , 记录仪走 纸 3 cm/ h , 管 速 3 管/ h . 洗 脱 液 : 用0.005 mol/ L (p H 7.0) P BS ( 含 0.2 mol/ L NaCl )至 01005 mol/ L ( p H 710 ) P BS ( 含 018 mol/ L NaCl) 梯度洗脱. 

1.6.3 HA 柱层分析 : 将上述收集得到的 PC 液 ,透析并适当浓缩 , 上柱 , 使 1/ 3 柱床着色. 柱型 :1.6 cm × 20 cm、 流速 10 ml/ h , 检测灵敏度0.2 A ,走纸 3 cm/ h , 管 速 6 管/ h , 梯 度 洗 脱 , 上 相 为0.1 m ol/ L (p H 7.0) P BS , 下相为 0.01 m ol/ L P BS ,均含 0.2 m ol/ L NaC l , 收集深蓝色的 PC 组分. 

1.6.4 S ep hadex G 2 200 : 上述纯化的 PC 浓缩液 ,离心去沉淀 , 再经过一次 S e p hadex G 2 200 分子筛.洗脱液为 : 0.01 mol/ L P BS ( 0.2 mol/ L NaCl ) ,流速 15 ml/ h . 检测灵敏度为 011 A , 走纸 3 cm/ h ,管速 6 管/ h , 收集单一洗脱峰部分. 

1.7 聚丙烯酰胺凝胶电脉 ( PAGE )    

        聚丙烯酰胺浓度分离胶为 715 % , 浓缩胶为3.75 %. 加速剂分离胶用过硫酸铵 , 浓缩胶用核黄素. 起始 100 V 电泳 , 样品进入分离胶后 200 V电泳 3~4 h , 溴酚蓝前沿走出胶后 015 h 内停止电泳 , 剥胶 , 水∶ 二甲醇∶ 冰醋酸 ( 5 ∶ 5 ∶ 2) 为溶剂的0.1 %的考马斯亮蓝 R 2 250 染液固定染色 4~10 h ,30 %甲醇的 10 %醋酸脱色 , 保存于 7 %醋酸中. 

2   主要结果 

2.1 分级分离结果分析

 2.1.1 S ep hadex G 2 200 柱层析 : 上样后 , 样品在柱面呈一窄的深蓝色区带 , 洗脱过程 , 可观察到一较宽的淡黄色区带首先被洗脱下来 , 随后是较窄的深蓝色的 PC 区带 , 最后还有一个无色的蛋白质峰 ( 图 1) .   此步骤黄色的大分子很快被洗脱 , 有利于其后的离子交换和 HA 吸附层析. 

2.1.2  D EA E 2S ep hadexA2 25 : 上样后深蓝色区带被压缩吸附在柱层顶端 , 随洗脱梯度增加依次有三个蛋白质峰出现. 首先是一无色的低而宽的蛋白质峰 , 然后是深蓝色的 PC 峰出现 , 最后是淡蓝绿色的小峰 ( 图 2) . 在洗脱过程中应不时调整吸去柱床顶的洗脱液以维持梯度的正确线性增长. 这是因为离子交换密度很高 , 造成随洗脱浓度离子强度的提高 , 床体体积缩小. 

2.1.3 HA 柱层析 : 随洗脱液磷酸盐离子强度的提高 , 只有一个明显的峰被洗脱下来 , 呈深蓝色 ( 图 3) . 图 3   PC 的 H A 的层析图谱

2.1.4 S ep hadex G 2 200 分子筛 : 从上面洗脱峰所获样品再次经 S ep hadex G 2 200 层析只有一个对称的窄而高的蛋白质峰 , 即 PC 峰 , 进一步去除了少量残留的杂蛋白 S eph a d ex G 2 200 分子筛图谱 ,经过以上分离纯化程序最终获得 A 615/ A 280 ≈14 的 PC , 证 明 其 分 辨 力 达 到 电 泳 单 一 区 带 的水平. 

2.2 PC 纯度分析

        测定各级分离提纯程序 , 并总结PC 的各级纯化结果分离程序 A615/ A280粗提 0190( N H4)2SO4 盐析 1120Sep hadexA2 200 层析 4160DEAE 2Sep hadex G 2 25 5180HA 7180Sep hadex G 2 200 分子筛 14147。由 此可 见 纯 度 逐 级 提 高 , 最 后 纯 度 为14147 , 超过国内外报道的最高值 10 . 层析后的PC 经过聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 各重复组均显示单一的蓝色条带 , 这种蓝色是 PC 特有的表征 , 染色脱色后未发现其他杂蛋白色带存在 

2.3.1 分离纯化后 PC 的紫外2 可见光谱 : 从 纯化后 PC 的紫外2 可见吸收光谱 ( p H 710) · 9 5 4 · 1999 ; 26 ( 5)  中可以看出 , PC 在 615 nm 有最大光吸收。

2.3.2 p H 对 PC 的紫外2 可见光谱影响 : 对 PC 液分别在 p H 310 、 p H 710 、 p H 13 时测定紫外2 可见吸收光谱 , 可见 p H 变小 , PC 的可见光最大吸收峰蓝移 , p H 变大 , 则红移 。PC 在中性条件下荧光激发峰有两个 : 分别位于 590 nm 和 635 nm  , 荧光发射峰仅一个位于 650 nm  , 且 两 个 激 发 波 长 590 nm 和635 nm 分 别 激 发 时 , 最 大 荧 光 峰 不 变 , 均 为650 nm. 

3   讨    论

 3.1 PC 的提取方法很多 , 有溶菌酶法 、 低渗浸泡法 、 冻融法. 实验证明采用超声波与反复冻融相结合的方法 , 快速并且效果好. 

3.2 PC 的层析纯化 , 传统的是 HA 柱层析反复纯化 , 但层析过程中总留有一部分比重大的黄色液体 , 堵塞柱床 , 使洗脱不均匀 , 带不平整等. 先经过 S ep hadex G 2 200 分离后 , 黄色大分子很快洗脱下来 , 利于其后的 D EA E 2S ep hadexA2 25 离子交换和HA 吸附层析. 

3.3 经过 S ep hadex G 2 200 、D EA E 2S ep hadexA2 25 、HA 、 S ep hadex G 2 200 的纯化程序可获取高纯度的PC , 其纯度值 ( A 615/ A 280) 为 14 , S DS 2PA GE 呈一条带 , 所以可认为本品纯度超过国内外报道的最高值[ 2~4 ] . 

参   考   文   献

 1   Ver non T O I , G lazer A N. Flu ores cent p hyc obilip rot ein c onjngat es for analyses of cells and molecules. J Cell Bi ol , 1982 , 93 ( 3) : 981~986

 2   Lin H M. C o mparis on of S pi r ul i na s ub salsa wit h ot her S pi r ul i na s pecies. Act a Hydrobi ol ogica S inica , 1991 , 15 ( 1) : 27~34 

3  G lazer A N. C o mparative bi ochemist r g of p hofosynt hetic light2 harvesting syst ems. Ann Rev Bi ochem , 1983 , 52 : 125~157

 4   Liu Q F , Wang H , Zhang X K. Puri ficati on and p roperties of p hyc obilip rot ein of S pi r ul i na s ub salsa var . Act a Hydrobi ol ogica S inica , 1988 , 12 ( 2) 146~153 T h e Study f or I solat ion and Pu r i f i cat ion o f Phycocy an i n w it h H igh Pu r ity and I ts Sp ectr a Ch ar acter ist i cs. WAN G Y o ng , Q I AN K ai 2X ian ( De p a rt me n t of B i ol ogical S cie nce a n d Tech nol ogy , Zhej i a n g U ni ve r s i t y , Ha n gz hou 310027 , Chi na ) ; DON G Qiang ( I ns t i t u te of Me dical S cie nce , J i n a n 250062 , Chi na) . Abstr act   The p hyc ocyani n ( PC ) i s a ki nd of f l u o res cence molecular p r o be becaus e i t has charact eri st ic abs o rp t i o n s pect ra and f l u o res cence s pect ra. T o get highl y p uri f ied p hyc ocyani n , t he success ive p r ocedure of c ol umn chr o mato grap hy was s et u p wi t h S ep hadex G 2 200 、D EA E 2S ep hadex G 2 25 、 HA 、and S ep hadex G 2 200 . The resul t s showed t hat t he p uri t y st andral ( rat i o of A 615 / A 280 ) reaches to 14 at p H 710 , and i t has been demo nst rat ed by PA GE as a s i ngle band. K ey w ords  p hyc ocyani n , s pi r ul i n a s ub s als a var , c ol umn chr o mato grap hy , f l u o res cence s pect ra · 0 6 5       生物化学与生物物理进展    P rog. Bioch em. Biophys.       1999 ; 26 ( 5)